Planes del semestre Agosto 2008

Como había escrito anteriormente, durante este semestre llevare a cabo investigación en el laboratorio del Dr. Carlos I. González en UPR-RP. En este laboratorio demostraron que la proteína Upf1 está fosforilada en S. cerevisiae y se encontró que 11 lugares de fosforilación están conservados evolutivamente. Queremos identificar el rol de la fosforilación en el mecanismo de NMD, esto lo haremos haciendo mutaciones en esos 11 lugares de fosforilación que han sido identificados. Ya se han realizado 5 de las 11 mutaciones, mi meta en este semestre es hacer las mutaciones en las próximas 6 mutaciones. Para completar este objetivo haré lo siguiente:

 

1. Diseñar iniciadores ó “primers” para mutar amino ácidos fosforilados en Upf1

2. Hacer “site-directed mutagenesis” con PCR, con los primers diseñados para introducirlos en los plasmidios de la proteína

3. Digerir con DpnI para eliminar el DNA endógeno que está metilado.

4. Trasformar bacteria E.coli con la mutación

5. Hacer miniprep para aislar el plasmidio. Los mismos serán enviados a secuenciar para verificar que la mutación está presente.

6. Transformar  levaduras con los plasmidios conteniendo las mutaciones de interés

7. Hacer experimentos para determinar si la mutación tiene algún efecto en NMD.

8.    Haré Nothern blot para medir la media vida del mRNA.

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