Fin del Semestre

Este semestre fue uno interesante en el cual aprendí mucho más de mi proyecto. Desde el semestre pasado empecé haciendo mutaciones pero este semestre e hecho muchas más. Dentro de las mutaciones realizadas por “site-directed mutagénesis” se encuentran Serina 196 a Alanina, esto se codifica S196A, S199A. También se han realizado mutaciones dobles ya que puede que una mutación sola no haga efecto pero que juntas si porque puede que tenga funciones en conjunto. De las dobles se hicieron S196A-S199A. No vimos ningún efecto de estas mutaciones en la proteína de Upf1 en el non-sense mediated mRNA decay Pathway (NMD). Por lo cual hemos seguido haciendo más mutaciones de diferentes cantidades de combinaciones, las ultimas tenemos un DNA que es PCG 141 y este tiene una combinación de tres mutantes y a esta se le siguen añadiendo más, algunas tiene 5 mutaciones en la proteína a la vez. Antes de saber si estas tienen algún efecto en el NMD hay que hacer una serie de pasos; se transforma a E.coli, se extrae el plásmido del mismo por un miniprep, se manda a secuenciar para ver que las mutaciones están bien realizadas, se transforma a levadura y luego se hacen un Northern blot para RNA y Western blot para ver proteína. La mayoría de las mutaciones realizadas con el PCG 141 se han quedado hasta que se mandan a secuenciar ya que cuando llega la secuencia no se había nada en la misma, hubo algún error y algunas vimos la mutación. En este momento toda va corriendo muy bien y estamos esperando las secuencias para seguir con nuestros experimentos. Los planes para el semestre que viene es seguir haciendo más mutaciones y de las hechas hacer los Northern Blot y Western Blot. Queremos encontrar una mutación que tenga algún efecto en el NMD.

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