Plan para semestre enero 2009

Un pequeño resumen de lo que se trata el proyecto. Se quiere encontrar las funciones de 11 lugares fosforilados que fueron encontrados en la proteína Upf1 en el mecanismo del “Nonsense-Mediated mRNA decay” en la levadura, S cerevisiae. Este mecanismo se encarga de degradar el mRNA que tienen codones de terminación prematuros. Para ver si estas fosforilaciones son funcionales para activar NMD, se generan mutaciones en los lugares fosforilados y observamos si tienen algún efecto en la degradación del mRNA que contiene un codón de terminación prematuro.

Durante este semestre se continuarán generando mutaciones en los once lugares fosforilados ya que las realizadas hasta el momento no han reflejado tener algún  efecto en el mecanismo de NMD. Me concentraré más en generar las mutaciones: S54A, S56A, S58A y combinaciones de las mismas, T194A, y combinaciones de ésta con S196A, S199A (estas ya fueron realizadas el semestre de Agosto 2008)

Para lograr lo mismo se sigue una metodología con la cual ya estoy familiarizada. Se lleva a cabo una reacción de PCR con unos iniciadores que contienen la mutación en su secuencia. Luego de llevar a cabo la amplificación del DNA de interés, se transforman las bacterias E. coli. El DNA es luego aislado de las células transformadas y este se envía a secuenciar. Luego, se transforman las levaduras y se hace una extracción de proteínas y se analiza con un Western Blot, Luego se extrae el RNA y se analiza con Northern Blot. Hasta el momento no he realizado el Northern Blot ya que no estoy certificada para utilizar radioactividad pero recientemente fui entrenada por OPASO para llevar a cabo esta técnica. Northern Blot es una técnica con la cual se marca un mRNA con un isótopo radioactivo que en nuestro caso es fósforo 32, con la misma vemos si la mutación hecha tiene algún efecto en el NMD. Si tuviera algún efecto entonces veríamos una mancha la cual indica que el mRNA no fue degradado, pero cuando no tiene efecto no se ve nada en la fotografía ya que el mRNA ha sido degradado. Hasta el momento, no he obtenido alguna mutación que afecte el mecanismo de NMD y afecte la degradación de un mRNA que contenga un codón de terminación prematuro.

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