Al igual que todos los participantes de BioMinds tuvimos la oportunidad de evaluar los poster de 3 diferentes companeros. En esta evaluacion se analisaron y deterctaron ciertas partes que debian formar parte de los posters. Ademas se verifico si el poster estaba bien construido. Se hicieron por lo menos dos preguntas al investigador, de esto se evaluo si contenian el conocimiento sobre su tema.

Como se menciono realize 3 evaluaciones a los estudiantes Rafael Zayas, Lianette Rivera, Grace M. Berrios.
Sus Proyectos:
- Rafael Zayas: su proyecto fue “LIpia dulcis Effective Phytoremediator of soils contaminated with TNT”
-Lianette Rivera: “Spermacoce assurgens as effective phytoremediator of soils contaminated with polynitroaromatic compounds”
- Grace M Berrios: “Myeglebin encapsulation in Sol-Gels”
Todos hicieron un exelente trabajo, ya que dominaban bien su informacion y el proyecto presentado. su trabajos demostraron estar organizados y tener todos los requisitos que debian haber sido puesto en poster.

One third of inherited human genetic diseases are caused by mRNAs harboring premature termination codons (PTCs) as a result of nonsense mutations. These aberrant transcripts are recognized and rapidly degraded by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. NMD is important, as it greatly reduces the synthesis of truncated proteins, some of which possess deleterious gain-of-function effects. Upf1p, Upf2p, and Upf3p are central NMD components. Upf1p and Upf2p are phosphorylated both in yeast and humans. Phosphorylation of the N-terminal region of Upf2p is crucial for its ability to elicit NMD and for its interaction with Hrp1p, another NMD component. Upf1p phosphorylation is necessary for NMD activity in worms and humans. We have identified eleven phosphorylation sites in yeast Upf1p using mass spectrometry, some of which are conserved in higher eukaryotes. Mutations in some of these conserved residues disrupt NMD activity. A better understanding of NMD may permit the discovery of approaches to modulate the stability and translation of aberrant mRNAs as a means to combat cancer and other human genetic disorders caused by nonsense mutations.
AVR is supported by the Amgen BioMINDS at UPR Program from the Amgen Foundation. This work is also supported by RISE Award 2R25GM61151, NIH U54 Award CA96297-03, NIH-NIGMS SCoRE Award GM008102-305, FIPI-UPR and grant P20 RR016174 from NCRR, a component of the NIH.

Un pequeño resumen de lo que se trata el proyecto. Se quiere encontrar las funciones de 11 lugares fosforilados que fueron encontrados en la proteína Upf1 en el mecanismo del “Nonsense-Mediated mRNA decay” en la levadura, S cerevisiae. Este mecanismo se encarga de degradar el mRNA que tienen codones de terminación prematuros. Para ver si estas fosforilaciones son funcionales para activar NMD, se generan mutaciones en los lugares fosforilados y observamos si tienen algún efecto en la degradación del mRNA que contiene un codón de terminación prematuro.

Durante este semestre se continuarán generando mutaciones en los once lugares fosforilados ya que las realizadas hasta el momento no han reflejado tener algún  efecto en el mecanismo de NMD. Me concentraré más en generar las mutaciones: S54A, S56A, S58A y combinaciones de las mismas, T194A, y combinaciones de ésta con S196A, S199A (estas ya fueron realizadas el semestre de Agosto 2008)

Para lograr lo mismo se sigue una metodología con la cual ya estoy familiarizada. Se lleva a cabo una reacción de PCR con unos iniciadores que contienen la mutación en su secuencia. Luego de llevar a cabo la amplificación del DNA de interés, se transforman las bacterias E. coli. El DNA es luego aislado de las células transformadas y este se envía a secuenciar. Luego, se transforman las levaduras y se hace una extracción de proteínas y se analiza con un Western Blot, Luego se extrae el RNA y se analiza con Northern Blot. Hasta el momento no he realizado el Northern Blot ya que no estoy certificada para utilizar radioactividad pero recientemente fui entrenada por OPASO para llevar a cabo esta técnica. Northern Blot es una técnica con la cual se marca un mRNA con un isótopo radioactivo que en nuestro caso es fósforo 32, con la misma vemos si la mutación hecha tiene algún efecto en el NMD. Si tuviera algún efecto entonces veríamos una mancha la cual indica que el mRNA no fue degradado, pero cuando no tiene efecto no se ve nada en la fotografía ya que el mRNA ha sido degradado. Hasta el momento, no he obtenido alguna mutación que afecte el mecanismo de NMD y afecte la degradación de un mRNA que contenga un codón de terminación prematuro.

Fue una gran experiencia ya que pude aprender no solo de lo que yo trabajo sino también de otros temas. Las charlas provista fueron excelentes especialmente las que daban luego del las comidas, eran muy jocosas e interesantes a la misma vez. Luego tuvimos la oportunidad de estar en un gran salón donde estaban los exhibidores y estos fueron de gran ayuda para tener una visión más clara del futuro. En los exhibidores podías encontrar muchísimas universidades de Estados Unidos y Latinoamérica. Con ellas pude saber que universidades puedo tener en mente y los requisitos previos que debo hace como subgraduada para se admitida en alguna de ellas. En este salón también podías encontrar las presentaciones de los poster y en esos espacios cada uno presento. Me gusto que estaba dividido por categoría y si te interesaba alguna que no era la tuya podías ir y aprender de diferentes proyectos. En mi presentación de la conferencia presente un póster sobre el proyecto que eh estado trabajando desde que empecé en el laboratorio que fue a la par con Bio MINDS. Con los jueces me fue excelente, tan así que me gane un premio en la categoría de Biología molecular.

Este semestre fue uno interesante en el cual aprendí mucho más de mi proyecto. Desde el semestre pasado empecé haciendo mutaciones pero este semestre e hecho muchas más. Dentro de las mutaciones realizadas por “site-directed mutagénesis” se encuentran Serina 196 a Alanina, esto se codifica S196A, S199A. También se han realizado mutaciones dobles ya que puede que una mutación sola no haga efecto pero que juntas si porque puede que tenga funciones en conjunto. De las dobles se hicieron S196A-S199A. No vimos ningún efecto de estas mutaciones en la proteína de Upf1 en el non-sense mediated mRNA decay Pathway (NMD). Por lo cual hemos seguido haciendo más mutaciones de diferentes cantidades de combinaciones, las ultimas tenemos un DNA que es PCG 141 y este tiene una combinación de tres mutantes y a esta se le siguen añadiendo más, algunas tiene 5 mutaciones en la proteína a la vez. Antes de saber si estas tienen algún efecto en el NMD hay que hacer una serie de pasos; se transforma a E.coli, se extrae el plásmido del mismo por un miniprep, se manda a secuenciar para ver que las mutaciones están bien realizadas, se transforma a levadura y luego se hacen un Northern blot para RNA y Western blot para ver proteína. La mayoría de las mutaciones realizadas con el PCG 141 se han quedado hasta que se mandan a secuenciar ya que cuando llega la secuencia no se había nada en la misma, hubo algún error y algunas vimos la mutación. En este momento toda va corriendo muy bien y estamos esperando las secuencias para seguir con nuestros experimentos. Los planes para el semestre que viene es seguir haciendo más mutaciones y de las hechas hacer los Northern Blot y Western Blot. Queremos encontrar una mutación que tenga algún efecto en el NMD.

Este proyecto es uno continuo ya que hacemos mutaciones en once lugares fosforilados de una proteína. Con cada mutación se sigue una serie de pasos para confirmar si la mutación tiene algún efecto en el Nonsense Mediated Decay pathway.

La primera sección de mutaciones realizadas a sido completada un 90% ya que los resultados obtenidas de estas son los que presentare en ABRCMS meeting en Orlando. A la misma que se están haciendo más mutaciones desde dobles hasta quintuples, también en estas se siguen todos los pasos que se siguieron para la otra: se hace la mutación por PCR (site directed mutagenesis), se transfieren a E.Coli, se hace un miniprep y el resultado de este se manda a secuenciar, se transfiere a levadura, se hace una extracción de levadura, se realiza un Western blot y Northern blot.

El NMD es un mecanismo que regula las proteínas y gracias a este se degradan mutaciones que dañan las proteínas. Estas proteínas defectuosas son las que provocan el cáncer.

Con las mutaciones que se están realizando se está tratando de ver que efecto en el NMD tienen estos lugares fosforilados que se ha visto que están conservadas.

En este semestre todavia no eh aprendido ninguna tecnica nueva pero sigo aplicando las tecnicas que ya habia aprendido el semestre pasado. Pronto aprendere a hacer Western blot ya que e sido certificada para utilizar radioactividad.

De mis metas e realizado como un 50% de mis metas, por lo cual me clasificaría en 3. No e podido avanzar mas ya que las mutaciones que e estado realizando no se han logrado, pero estamos utilizando un primer nuevo y estamos haciendo las mutaciones otra vez para mandarlas a secuenciar.

Como había escrito anteriormente, durante este semestre llevare a cabo investigación en el laboratorio del Dr. Carlos I. González en UPR-RP. En este laboratorio demostraron que la proteína Upf1 está fosforilada en S. cerevisiae y se encontró que 11 lugares de fosforilación están conservados evolutivamente. Queremos identificar el rol de la fosforilación en el mecanismo de NMD, esto lo haremos haciendo mutaciones en esos 11 lugares de fosforilación que han sido identificados. Ya se han realizado 5 de las 11 mutaciones, mi meta en este semestre es hacer las mutaciones en las próximas 6 mutaciones. Para completar este objetivo haré lo siguiente:

1. Diseñar iniciadores ó “primers” para mutar amino ácidos fosforilados en Upf1

2. Hacer “site-directed mutagenesis” con PCR, con los primers diseñados para introducirlos en los plasmidios de la proteína

3. Digerir con DpnI para eliminar el DNA endógeno que está metilado.

4. Trasformar bacteria E.coli con la mutación

5. Hacer miniprep para aislar el plasmidio. Los mismos serán enviados a secuenciar para verificar que la mutación está presente.

6. Transformar  levaduras con los plasmidios conteniendo las mutaciones de interés

7. Hacer experimentos para determinar si la mutación tiene algún efecto en NMD.

8.    Haré Nothern blot para medir la media vida del mRNA.

En este verano estuve en Houston, TX en un internado en el programa Step Up 2008 Clinical and Research Program. El mismo consistía en 4 semanas de clases de anatomía humana con su laboratorio, luego 6 semanas haciendo investigación en el Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas. Estuve investigando en el Departamento de Imaging Physics.  Mi proyecto utilizaba “Metastatic Prostate Cancer Cells” (PC3·MM2) a diferentes temperaturas (37 – 57 C) y a diferentes tiempos (1 -10 minutos) para ver la expresión de “Heat shock proteins70” (HSP70) con un “dual reporter system” sin tener que extraer los tumores. Con este sistema reportero queremos comparar la expresión de HSP70 con la vida de la célula. Estos experimentos se llevaron a cabo in·vitro.